微生物与生化技术杂志

抽象的

预处理对 qPCR 检测细菌的影响 - 细菌指标，以肠球菌为模型

Shin Giek Goh 和 Karina Yew-Hoong Gin

现行的娱乐用水指南（例如美国环境保护署和世界卫生组织）建议将肠球菌作为淡水和海水的指标。几十年来，人们一直使用基于培养的方法来量化肠球菌的存在。2012 年，美国环境保护署娱乐用水指南将 qPCR 列为检测肠球菌的替代方法。与基于培养的方法相比，qPCR 方法不需要较长的培养时间。此外，它还具有高特异性和灵敏度检测的优势。尽管如此，qPCR 仍受到三个主要限制因素的阻碍。qPCR 分析的少量样品中靶细胞有限，抑制剂的存在很容易影响 qPCR 的灵敏度检测，以及游离 DNA（从死细胞中释放的 DNA）的持续存在会导致 qPCR 中的假阳性信号。因此，上游处理对 qPCR 检测的准确性至关重要。三种不同的预浓缩方法（i）用尼龙膜过滤； (ii) 用聚碳酸酯膜过滤和 (ii) 离心，检查了它们的回收率。发现无论样品基质如何，用聚碳酸酯膜过滤都能提供更高的回收效率和一致性结果。根据提取的 DNA 的纯度和提取的相对回收效率对常规 DNA 提取和两种市售的 DNA 提取试剂盒进行了评估。结果表明，市售试剂盒 QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen) 的性能最佳。事实证明，在 QIAamp® DNA Mini Kit 中使用二氧化硅膜可以提高 DNA 回收率，同时将抑制剂的干扰降到最低。对叠氮化乙锭 (EMA) 和叠氮化丙锭 (PMA) 在降低 qPCR 中的假阳性信号方面的表现进行了评估。PMA 似乎可以提供更好的选择来减少膜受损细胞中 DNA 的假阳性检测。