干细胞研究与治疗杂志

抽象的

小鼠间区细胞的激光捕获显微切割：层选择和 RNA 产量预测

Florien Jenner、Gerjo JVM van Osch、Mairead Cleary、Iris Ribitsch、Ulrich Sauer、René van Weeren 和 Pieter Brama

目的：关节软骨细胞来源于胚胎发育关节中所谓的间区内一群独特的祖细胞。我们进行这项研究的目的是：1）确定是否有可能在不进行原位杂交或免疫组织化学的情况下，通过组织学方法（使用甲酚紫）识别中间和外部间区层；2）确定是否可以从单个胚胎的每个间区层中收获足够量的 RNA 以进行基因表达分析；3）开发可以在昂贵的扩增步骤之前提供 RNA 产量估计值的测量方法。方法：使用激光捕获显微切割 (LCM) 收获了 13.5 天和 15.5 天妊娠小鼠胚胎的新生股胫关节的外部 (OI) 和中间 (II) 间区以及股骨和胫骨的骨骺软骨 (EC) 细胞。随后，进行微阵列分析以确认适当的层选择。测量了 LCM 期间采集的表面积和拍摄的显微照片的灰度值 (gv)，并计算了相应的相对光密度 (ROD)，并确定了与 RNA 产量的相关性程度和显著性。结果：可以使用甲酚紫染色在组织学上识别来自 OI、II 和 EC 的细胞，并成功用 LCM 采集了足够量的 RNA 以进行线性扩增和微阵列分析。RN​​A 产量与采集的组织表面积、平均 gv 和相应的 ROD 显着相关。结论：本研究提供了一种选择性激光捕获显微切割和随后对小鼠中间层和外层间区细胞进行微阵列分析的技术，并提出了一种通过测量采集的组织面积和计算 ROD 来估计 RNA 产量的方法。我们建议至少收获 1×106 μm2 的 13.5 天小鼠胚胎和 3×106 μm2 的 15.5 天小鼠胚胎，以获得约 10 ng 总 RNA，可用于基于线性 T7 的扩增和随后的微阵列分析。