生物化学与分析生物化学

抽象的

使用二氯荧光素作为探针监测钙对线粒体 ROS 生成的影响

奥尔加·V·阿科波娃、柳德米拉·科尔钦斯卡娅和瓦伦蒂娜·诺萨尔

二氯荧光素 (DCF) 被广泛用于监测细胞和分离线粒体中的活性氧 (ROS) 生成。我们的目的是比较使用 DCF 监测分离线粒体中伴随 Ca2+ 运输的 ROS 形成的不同方法。使用两种 DCF 应用模式研究了 Ca2+ 对大鼠脑和肝线粒体中 ROS 生成的影响：第一种是用 DCF 前体二氯荧光素二乙酸酯 (DCFDA) 预加载储备线粒体悬浮液，另一种是将 DCFDA 的等分试样直接添加到培养液中。钙增加了脑和肝线粒体中 ROS 的生成，无论是在稳态条件下还是在非平衡条件下，这是由细胞色素 c 的逐渐释放和电子流的门控引起的。使用 DCF 预加载的线粒体，我们已经证明稳态条件下 ROS 的形成速率与 Ca2+ 循环和 Ca2+ 刺激的呼吸速率呈线性关系。过渡到非平衡状态导致 ROS 形成呈非线性上升，这也表现出对 Ca2+ 浓度的依赖性。虽然在 DCF 预载的线粒体中，DCF 荧光密切跟随 Ca2+ 转运的时间过程，但在未加载的线粒体中，探针加载会干扰 ROS 形成的检测，因为 DCF 浓度不断变化到基质空间中。根据实验，我们得出结论，预载在线粒体中的 DCF 可以作为合适的探针来监测 Ca2+ 转运对 ROS 生成的影响。