致癌与突变杂志

抽象的

使用 E18 细胞模型量化 DNA 链断裂相关旁观者效应 (DSB-ABE)

贾拉尔·纳西尔

淋巴母细胞系 E18 是 TK6 的衍生物，在杂合TK1 / tk1基因的内含子 2 中有一个 I-Sce1 插入片段。可以用 I-Sce1 限制性内切酶靶向 E18，在 I-Sce1 位点诱导双链断裂，以测量辐射独立的 DNA 损伤和相关的旁观者效应。为了构建 E18 细胞系，将 Eco47III 位点插入 pTK-UAS 线性化质粒骨架中，并在 DNA 连接酶存在下与 ISce1 限制序列的平端寡核苷酸退火。通过用 pTK-UAS-Eco47III-Sce1 热转染细胞并选择氨苄青霉素抗性菌落来转化 DH5-α 细胞。提取质粒 DNA 并分析 Eco47III 和 I-Sce1 位点的存在。选择一个在胸苷激酶活性等位基因内含子 2 中具有 I-Sce 位点的克隆进行进一步实验，并将其命名为 E18。测试该模型以证明双链断裂诱导的突变，并且这些链断裂还可以产生 DNA 链断裂相关的旁观者效应 (DSB-ABE)，这可以通过幼稚细胞中突变频率的增加来衡量。携带 GFP 标记的质粒 pAdTrackCMV I-Sce1 在 E18 细胞中电穿孔以表达 I-Sce1 限制性内切酶，该酶专门靶向活性 TK 等位基因内含子 2 处的 I-Sce1 位点。采用突变分数测定来测量直接突变分数 (DMF)，或伴随条件培养基转移到幼稚细胞以测量旁观者突变分数 (BMF)，作为通过 pAdTrackCMV I-Sce1 用外源 I-Sce1 表达靶向 E18 的终点，以诱导 DNA 损伤并量化 DMF 和 BMF。